ESC 2024十佳摘要之一｜金玮教授团队：心肌细胞RBM20高表达调节自噬相关可变剪接促进扩张型心肌病新机制研究

2024-09-02 18:08:45

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研究背景

RNA结合基序蛋白20（RBM20），是一种高表达于心脏组织的可变剪接因子，其可通过调节肌联蛋白（Titin）、钙调蛋白激酶（CaMK）等可变剪接体，影响心室顺应性和收缩功能，从而参与心衰和扩张型心肌病的发生发展。但既往研究多集中于RBM20的失活突变或敲除模型，故有学者认为提高RBM20活性，可改善心室顺应性从而作为一种抗心衰干预手段。然而，现有研究对非RBM20相关突变的特发性扩张型心肌病患者中RBM20的表达情况及功能作用仍缺乏证据。同时，RBM20对心肌细胞中RNA前体转录本的调控平衡作用仍有待全面阐释。

研究方法

通过构建条件性心肌细胞特异性RBM20过表达小鼠，评估RBM20表达增加对于心脏功能的影响。基于双荧光素酶和染色质免疫沉淀明确RBM20的调节因子，借助透射电子显微镜、lysotracker和Stub-RFP-Sens-GFP-LC3报告系统在体内外层面评估自噬流变化。

研究结果

首先，研究者通过多项GEO数据库挖掘和组织切片免疫荧光发现RBM20在特发性非缺血性扩张型心肌病患者心脏组织中的表达增加。进一步实验验证了RBM20在体内体外阿霉素干预诱导的扩心模型中也均出现表达显著升高，提示RBM20与扩张型心肌病进展密切相关。（图1）

图1

然后，研究者构建条件性心肌细胞特异性RBM20过表达小鼠，发现该品系小鼠诱导后短期生存率下降，且迅速出现自发的扩张型心肌病表型。与此同时，透射电子显微镜和蛋白免疫印迹发现RBM20过表达小鼠心脏组织中线粒体肿胀，溶酶体增多，自噬标志物表达增加。（图2）

图2

接着，研究者们基于多种手段发现RBM20表达增加的潜在转录调控因子c-JUN。进一步通过双荧光素酶报告基因试验及染色质免疫共沉淀技术和c-JUN抑制剂综合验证，c-JUN在特发性扩张型心肌病患者心脏组织中诱导RBM20表达增加。（图3）

图3

随后，为探究RBM20影响心肌细胞自噬通路的确切过程，研究者们通过调控体外心肌细胞中RBM20表达、氯喹干预、酸性示踪染料LysoTracker和基于慢病毒的Stub-RFP-Sens-GFP-LC3示踪系统，证实扩张型心肌病中RBM20高表达通过提高溶酶体pH导致自噬流阻滞。（图4）

图4

为进一步明确RBM20高表达引起自噬流阻滞的分子机制，研究者使用rMATS程序对RBM20过表达小鼠心脏组织RNA-seq数据进行深入挖掘。结果发现膜蛋白Atp6v0a1基因发生外显子跳跃现象。Atp6v0a1编码溶酶体膜上质子通道质子转运亚基蛋白，参与调控溶酶体酸化。借助不同区段PCR扩增、DNA凝胶实验、Sanger测序、eCLIP测序数据库等多种方式，证实了RBM20高表达导致Atp6v0a1的第6-7号外显子发生跳跃现象。（图5）

图5

最后，研究者发现体外回补Atp6v0a1全长质粒可缓解阿霉素诱导的自噬流阻滞及溶酶体酸化障碍，有助于更全面地认识RBM20对心肌细胞转录本的调控功能。（图6）

图6

研究结论

本研究首次揭示在非缺血性特发性扩张型心肌病患者中，RBM20表达增加可影响心肌细胞转录本调控平衡，导致Atp6v0a1错误可变剪切体产生，导致溶酶体酸化障碍的全新机制。该研究进一步丰富了RBM20蛋白剪接调控功能在心衰心肌病中的理论认识，指出Atp6v0a1和溶酶体酸化功能可能是扩张型心肌病的潜在干预靶点。