用于封堵室间隔缺损的生物全降解聚对二氧环己酮材质的封堵器

2024-08-22 19:50:00

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Zefu Li ^a,1, Pengxu Kong ^a,1 , Xiang Liu ^b,c , Shuyi Feng ^a , Wenbin Ouyang ^a , Shouzheng Wang ^a , Xiaopeng Hu ^a , Yongquan Xie^a , Fengwen Zhang ^a , Yuxin Zhang ^d , Rui Gao ^c , Weiwei Wang ^c,e,* , Xiangbin Pan ^a,e,**

^a Department of Structural Heart Disease, National Center for Cardiovascular Disease, China & State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, National Health Commission Key Laboratory of Cardiovascular Regeneration Medicine, National Clinical Research Center for Cardiovascular Diseases, Beijing, China

^b Tianjin Key Laboratory of Biomaterial Research, Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Tianjin, China

^c Department of Polymer Science and Engineering, Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin, 300072, China

^d Research and Development Department, Lepu Medical Technology (Beijing) Co, Ltd, Beijing, 102200, China

^e Key Laboratory of Innovative Cardiovascular Devices, Chinese Academy of Medical Sciences, China

摘要

室间隔缺损（VSD）是最常见的先天性心脏病（CHD）之一。目前用于治疗室间隔缺损的封堵器主要由镍钛合金制成，存在镍过敏、持续心肌磨损和致命心律失常的风险。在此，我们开发了一种生物全降解的聚对二氧环己酮（PDO）封堵器，其配备有成型线和聚乳酸PLLA膜，用于VSD封堵，无附加金属显影标记物。PDO封堵器具有良好的机械强度、抗疲劳性、几何形状适应性、生物相容性和降解性能。在大鼠皮下植入模型中，与镍钛合金相比，PDO丝材显著减轻了炎症反应，减轻了纤维化，促进了内皮化。PDO封堵器的安全性和有效性在实验犬室间隔缺损模型中得到了3年随访的证实，表明生物全降解的PDO封堵器不仅可以有效修复室间隔缺损，诱导心脏组织重塑，还可以解决与金属封堵器相关的并发症。此外，一项针对五名室间隔缺损患者的初步临床试验表明，所有封堵器都在超声心动图的引导下成功植入，在3个月的随访期间没有发生任何不良事件。总的来说，生物全降解PDO封堵器对于临床VSD封堵是安全有效的，在治疗结构性CHD方面有很广阔的前景。

介绍

室间隔缺损（VSD）是最常见的先天性心脏病之一^[1,2]，如果不予治疗，会导致肺动脉高压和艾森曼格综合征，死亡率很高^[3,4]。在过去的几十年里，与开胸手术相比，经导管封堵室间隔缺损已成为一种首选的治疗方法，因为它具有微创和并发症少等优点^[5,6]。目前，由于镍钛（Ni-Ti）合金具有形状记忆和超弹性，用于VSD封堵的商用封堵器由镍钛合金制成。然而，临床研究表明，永久留存在心脏内的金属封堵器可能会导致严重的并发症，如镍过敏、心肌磨损、瓣膜损伤、传导阻滞和血栓栓塞事件，总体发生率在0.1%至8.6%之间^[7-12]，主要归因于金属离子的长期释放、对周围心脏组织的持续压迫、持续的炎症反应和内皮化过程的延迟。

生物可降解的医疗器械为避免植入物永久性留存体内提供了一种有前景的替代方法^[13-17]。聚乳酸（PLLA）和聚对二氧环己酮（PDO）等生物降解材料具有良好的生物相容性，可以完全降解为二氧化碳和水，自20世纪80年代以来，此类材料已被FDA批准用于外科缝合线和血管内支架的临床应用。由生物可降解聚合物制成的封堵器可以提供临时闭合，并诱导原位组织再生，有望解决传统金属封堵器的相关问题。临床试验证明了PLLA和胶原封堵器在房间隔缺损（ASD）封堵术中的可行性和安全性^[18,19]。然而，目前的可生物降解封堵器保留了金属支架，以便提供机械支撑力并且能提高X射线下的可见度，此类封堵器不能完全降解，仍然面临上述风险^[20,21]。此外，到目前为止，还没有一种生物可降解的封堵器是为VSD封堵而设计的。与ASD相比，VSD具有更复杂的解剖结构（例如，更靠近房室瓣和传导通路），对血流动力学的影响更大，这对生物可降解封堵器的形态设计、机械性能和促内皮化提出了更高的要求。因此，使用完全生物降解的封堵器封堵VSD仍然是一个重大的临床挑战。

为了解决镍钛合金封堵器留存在心脏中引起的问题，我们开发了一种用于经导管VSD封堵的生物全降解PDO封堵器（图1）。双盘PDO封堵器由骨架和阻流膜组成。我们的研究结果表明，PDO具有优异的力学性能、几何形状适应性、生物相容性和可降解性。皮下植入物表明，与镍钛合金相比，PDO纤维可以显著减轻炎症，募集促修复的M2巨噬细胞，减轻纤维化，促进内皮化。在超声多普勒引导下，使用PDO封堵器在实验犬体内成功完成了经胸VSD封堵术。3年的随访数据表明，PDO封堵器增强了心脏组织浸润，并伴有中度炎症反应。内皮化过程比其降解过程快，保证了没有残余分流或位移发生。意外心律失常的发生频率随着封堵器的降解而降低，没有观察到致命的心律失常。在一项针对5名VSD患者的初步临床研究中，封堵器成功植入，有效封堵了VSD，在3个月的随访期间没有出现残余分流、瓣膜损伤和致命性心律失常等不良事件。总之，在我们的从实验室到床边转化研究中，PDO封堵器在治疗VSD方面显示出比镍钛合金封堵器更优越的安全性和有效性，为进一步的大规模临床试验带来了广阔的前景。

图1 PDO封堵器封堵VSD示意图。（A）与镍钛合金封堵器相比，具有生物相容性的全降解PDO封堵器可以显著减轻炎症并促进内皮化。（B）PDO封堵器的安全性和有效性在大鼠皮下植入模型、犬VSD模型和5名VSD患者的初步临床应用中得到了验证。（C）对实验犬VSD模型的3年随访证实了封堵器诱导心脏修复的过程。

材料

2.1 封堵器的制造

生物全降解封堵器由PDO骨架和PLLA阻流膜组成。PDO丝材是通过熔融纺丝制成的。将数均分子量为180 kDa的PDO颗粒（上海形状记忆合金有限公司）加热至160℃。熔化后，将PDO从纺丝机中挤出并在水浴中冷却，形成直径为0.15 mm的单丝。将长度为3 m的PDO单丝编织成网管并放入设计的模具中。将PDO加热至100℃60分钟，然后冷却至室温，形成双盘形状。之后，用熔融纺丝法制备两层厚度为0.1 mm的PLLA闭塞膜，用激光切割成匹配尺寸，并用PDO单丝固定在封堵器的盘面和腰部内。

2.2 PDO的物理和化学特性

使用AVANCE IIITM HD 400 MHz（瑞士NanoBAY）通过¹H核磁共振（¹H NMR）光谱确定聚合物的结构。使用四甲基硅烷（TMS）作为内标，将样品溶解在六氟异丙醇中。

使用40 kV和40 mA的Cu Kα辐射（λ=1.5418）在5-90^◦的范围内以5^◦/min的速率通过X射线衍射（XRD）（日本Rigaku Ultima IV）测量聚合物的结晶性能。

使用PL GPC 50（英国polymer Laboratories）在30℃下通过凝胶渗透色谱法（GPC）分析聚合物的分子量和多分散性。使用六氟异丙醇作为洗脱剂，流速为1.0 mL/min。样品浓度为1 mg/mL。

通过差示扫描量热法（DSC）（美国DSC Q2000）测定聚合物的热性能。将PDO样品加热至160℃并保持5分钟以消除热历史，然后以10℃/min的速度冷却至-80℃，并以相同的速度重新加热至160℃。

通过热重分析（TGA）（日本Rigaku TG-DTA8122）测量聚合物的热稳定性。在温度范围为30至450℃的氮气环境中以5℃/min的速率测量重量损失。

PDO丝材的机械性能通过电子万能试验机（美国Instron）进行评估。PDO样品的长度为3cm，直径为0.15mm。拉伸速度为15mm/min。

2.3 PDO封堵器样品的疲劳断裂分析

多样本疲劳测试系统（3330-MSF Series II，BAHENS，上海，中国）校准如下：载荷：±3000 N；偏移：±12.5毫米；加载精度：±0.5%；换档精度：±0.5%。将测试样品封堵器固定在具有13mm孔径和8mm厚度的盒式固定环的中心。将正确置入的封堵器浸入充满磷酸盐缓冲液的恒温水浴（37℃）中。

作为流入端面，在以1.2hz的稳定频率调整测试系统后，封堵器的左心室盘被迫达到2.55mm的单侧位移。使用立体显微镜（ZOOM645S，中国上海Wence）观察循环950万次后框架的断裂或裂纹。相应地记录了断裂、裂纹、变形、结构缺陷和其他形式的损坏。

2.4 PDO封堵器的形状恢复百分比

将PDO封堵器装载入10F导管，然后通过推送杆向前推，以模拟体外输送、置入和成型过程。在封堵器完全从10F输送鞘中释放后，成型线用于锁定盘形态。在每个操作步骤中，测量并比较封堵器在原始形状、输送、释放和成型时的左盘和右盘的直径。PDO封堵器的形状恢复百分比=盘直径（输送、释放和成型时）/初始形状时的盘直径。

2.5 毒性和溶血

CCK-8试剂盒用于评估PDO的细胞毒性。PDO样品用75%乙醇灭菌，用PBS冲洗，并在细胞培养基中浸泡24小时以获得提取液。L929细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板上，在37℃、5%CO₂环境中培养24小时，添加90%杜氏改良Eagle培养基（DMEM）、10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素。之后，用提取液替换细胞培养基，并将细胞再培养1、3和5天。用DMEM和CCK-8试剂盒（比例为9:1）的新培养基替换提取液，并将细胞再培养1小时。细胞培养基用作阳性对照。在450nm处测量吸光度。

Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测用于观察形态和细胞活力。将L929细胞以2*10⁴个细胞/孔的密度接种在24孔板上，在37℃、5%CO₂环境中培养24小时。然后将细胞在提取液中再培养3天和5天。用钙黄绿素/碘化丙啶混合溶液再孵育30分钟后，使用荧光显微镜（德国徕卡显微）评估细胞存活率/细胞毒性。活细胞用绿色（钙黄绿素）染色，死细胞用红色（碘化丙啶）染色。

新鲜兔全血在生理盐水中以4:5的体积比稀释。将PDO样品灭菌，在37℃下以1.25 cm²/10 mL的比例浸入10 mL生理盐水中30分钟。然后加入0.2 mL稀释的血液，在37℃下培养1小时。在3000g下离心5分钟后，收集样品的上清液，用酶标仪在545 nm处进行吸光度测量。无菌去离子水和生理盐水用作阳性和阴性对照。溶血率计算如下：溶血率（%）=（A_s-A_n）/（A_p-A_n）×100%，其中A_s、A_p和A_n表示样品、阳性对照和阴性对照的吸光度。

2.6 动物模型

体重在8.10至10.40公斤之间的比格犬被用于植入PDO封堵器。这些动物是从四川成都比格犬繁育基地（中国四川）和阜外医院实验动物中心（中国北京）购买和支持的。由维通利华实验动物技术公司（中国北京）提供，Sprague-Dawley大鼠（雄性，200-220g，6周）用于研究降解PDO纤维的生物相容性。本研究涉及的研究方案和动物福利已获得阜外医院动物研究伦理委员会（FW-2022-0014）和仁宠和宠物医院（ACU-2014shxz-0011）的批准。

2.7 大鼠皮下植入PDO

18只雄性SD大鼠用于皮下植入研究。手术前使用异氟烷对动物进行麻醉。剃掉背部毛发，在手术期间将动物放在加热垫上。通过动物背部中心1-2cm的皮肤切口进入背部皮下空间进行植入。从切口向动物肩胛骨进行钝性解剖。将PDO丝（长15mm，宽0.15mm）和镍钛合金丝（长15mm、宽0.15mm，上海形状记忆合金有限公司）植入每只大鼠的单独皮下组织上（每个时间点n＝3）。将皮肤切开缝合的SD大鼠设为假手术对照组（每个时间点n=3）。在植入后1周、1个月和3个月，采集感兴趣的皮下区域，并在4%福尔马林中固定3天，以进行进一步的组织学分析。

2.8 犬模型中的经导管VSD封堵

18只比格犬（雄性，8-10kg）通过右胸小切口植入PDO封堵器。麻醉后通过右胸3-4肋间切口进行开胸手术。暴露右心室游离壁以避开冠状动脉分支，并在右下角附近用4-0脯氨酸缝合线进行荷包缝合。接下来，将一根钝针穿过先前荷包缝合中心部的6F动脉鞘插入右心室游离壁。在经胸超声心动图（TTE）的指导下，针尖穿透室间隔，针刺完成。使用直径6mm的球囊扩张导管扩张室间隔缺损，以创建室间隔缺损模型。选择盘面直径11mm，腰高6mm的封堵器，与实验犬体内的VSD的大小相匹配。选用10F鞘管用于输送封堵器。将PDO封堵器连接到输送系统的夹钳上并装入鞘管，然后在超声引导下进入左心室。左盘在左心室腔内释放扩张。在确保左盘紧贴室间隔后，后退鞘管以展开右盘。收紧成型线以锁定双盘结构。超声心动图用于确认封堵器的位置并评估残余分流。在确认两个盘面均已良好展开和定位后，通过松开钳口释放封堵器。植入后静脉注射氨苄青霉素（1 g），所有比格犬术后接受阿司匹林（5 mg/kg/d）治疗3天。记录一般特征和实验室检测结果。

在1、3、6、12、24和36个月时对实验动物进行随访（每个时间点n=3）。我们在每个时间点都进行了经胸超声心动图、心电图和血液学检查。在不同随访时间点通过超声心动图测量封堵器左右盘的直径，以评估其降解情况。此外，在每个时间点牺牲三只实验比格犬后，分别进行了大体解剖检查、组织学评估和扫描电镜（SEM）观察。

2.9 组织学、免疫组织化学和免疫荧光染色

将固定的组织脱水并进一步包埋。皮下植入和心内封堵器的剖面用苏木精和伊红（H&E）、Masson三色法染色。这些图像是通过全载玻片成像系统（匈牙利Pannoramic，3Dhistech）获得的。通过ImageJ（2.1.0版，美国国家卫生研究院）定量测量不同皮下包埋组的胶原体积分数（CVF）和炎症面积分数。

采用免疫组化和免疫荧光染色标记物(补充材料)评估皮下植入，标记物包括CD68、CD206、iNOS（诱导型一氧化氮合酶）和CD31。通过激光共聚焦显微镜（徕卡SP8）和全载玻片成像系统（匈牙利Pannoramic，3Dhistech）获得图像。

2.10 蛋白质印迹分析

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的商用样品缓冲液（瑞士罗氏MagNA Lyser Green Beads）裂解从皮下植入部位收集的组织。使用BCA蛋白检测试剂盒（中国碧云天P0012）测定蛋白质浓度；使用NuPAGE 4-12%Bis-Tris凝胶（美国Invitrogen NP0322BOX）分离总蛋白，然后转移到0.45μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Merck Millipore IPVH00010）上。在室温下用QuickBlock™阻断缓冲液（中国碧云天P0252）阻断非特异性结合15分钟。然后将膜与相应的稀释一抗[小鼠抗-CD206（1:1000；60143-1-Ig，Proteintech）；兔抗CD31（1:1000，ab222783 Abcam）；兔抗-CD68（1:1000）；ab125212，Abcam）和兔抗iNOS（1:1000、18985-1-Ag，Proteitech）]在4℃下孵育过夜。GAPDH被用作使蛋白质带正常化的内部对照。用TBST洗涤3个循环周期，每个循环周期10分钟后，将膜与适当的二抗在室温下孵育1小时。使用超高灵敏度ECL化学发光试剂盒（中国碧云天P0018AS）观察特异性抗原-抗体结合带。通过自动化学发光图像分析系统（4600，Tanon，Shanghai）获得了代表性的蛋白质结合带。

2.11 初步临床研究

生物可降解PDO封堵器的初步临床研究在北京中国医学科学院阜外医院进行。所有程序均经阜外医院伦理委员会批准。已从所有患者/监护人处获得书面知情同意书。

本研究对膜周室间隔缺损患者进行了筛查。在经胸超声心动图的指导下，经导管植入直径为5-7mm的PDO封堵器^[22]。所有患者在出院时、30天和3个月时都接受了心电图和实验室检查。

2.12 统计分析

使用GraphPad Prism 8.3.0版进行统计分析。连续数据以平均值±标准差（SD）表示。学生t-检验用于两组之间的比较，单因素方差分析和Bonferroni事后检验用于分析多组之间的差异。统计显著性由*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示。

结果

3.1 全降解封堵器的设计

如图2A所示，全降解双盘封堵器由骨架和阻流膜组成。首先，将PDO颗粒熔融并挤压成单丝。之后，将PDO单丝切成2-5m长的一段，用于编织腰部直径为5-14mm的封堵器。单丝编织成网管，在模具中热定型，形成双盘形状。PDO材料的形状记忆和弹性不及镍钛合金，这可能会对封堵器从导管中释放后的形态产生不利影响。为了增强PDO骨架的结构适应性，在左侧盘上编织了一条由PDO单丝制成的成型线，在从导管中释放封堵器后，可以牵拉该成型线以收紧和固定盘形态（图2B和C）。腰部直径比盘面直径小5mm，以尽量减少封堵器对周围心脏组织的压迫（图2A）。PLLA阻流膜包裹在双盘内部，以进一步防止残余分流。输送系统由一个不锈钢弹簧管组成，弹簧管尖端有一个夹子（图2B）。右盘上的一个绳结设计用于在封堵器输送过程中夹紧封堵器（图2B）。值得注意的是，我们去除了所有金属标记物，这赋予了PDO封堵器完全的生物降解性。

图2 PDO封堵器的设计、特性、生物相容性。（A，B）PDO封堵器和输送系统的设计。（C）成型线收紧之前（上图）和之后（下图）从鞘管释放的PDO封堵器的形态。（D）¹H-NMR；（E）XRD；（F）TGA；（G）GPC；（H）PDO的DSC。（I）PDO单丝的拉伸试验。（J）抗疲劳测试后PDO封堵器右盘的显微图像。（K）CCK-8法测定细胞存活率。（L）PDO单丝溶血测试。

3.2 PDO的物理化学特性

生物材料的生物相容性、降解速率和力学性能取决于结晶度、分子量、分子量分布等物理化学性质。因此，我们对PDO的物理和化学性质进行了表征。PDO聚合物的结构通过¹H-NMR确定（图2D）。PDO的亚甲基信号分别为3.51ppm、3.36ppm和2.96ppm。通过GPC测定了PDO的分子量分布。如图2G所示，保留时间为11.6分钟。数均分子量Mn、重均分子量Mw、多分散性[Mw/Mn]分别为61 kDa、103 kDa和1.69。

通过XRD分析PDO的结晶状态，在22.4^◦处显示出特征衍射峰值（图2E）。通过TGA分析了PDO的热稳定性。TGA曲线显示分解范围为198至290℃，最大速率温度（Tmax）为276℃（图2F）。典型的DSC曲线显示，玻璃化转变温度、结晶温度和熔点分别发生在-7.15℃、39.09℃和109.54℃（图2H）。内热熔融焓（ΔH_m）计算为67.77 J/g。结晶度χc=ΔH_m/ΔH_m0=48.0%，其中ΔH_m0表示加热轨迹中完全结晶的PDO的熔融疗法，等于141.2 J/g^[23,24]。这些数据证明了PDO的热稳定性和热加工处理的适用性。

3.3 PDO封堵器的抗疲劳性能和形状恢复性能

VSD封堵器应承受>100 mm Hg的血流冲击，并在一天内经历约10万次收缩和舒张循环周期。因此，封堵器需要在高强度冲击下保持稳定的结构。PDO丝材拉伸测试表明，拉伸强度和断裂伸长率分别为200.17 mPa和38.6%（图2I）。

经过950万次疲劳测试（相当于3个月的心动周期），载荷为300sl0 N，位移为12.5 mm，PDO封堵器的结构完好无损。显微镜检查中未观察到封堵器断裂、破裂或分层（图2J和S1），表明PDO封堵器可以适应心室中的血压，且不会变形或断裂。

图S1 PDO封堵器的抗疲劳试验。(A) PDO封堵器固定在疲劳试验系统中。(B)抗疲劳试验后PDO封堵器左盘显微图像。(C)抗疲劳试验后PDO封堵器腰部显微图像。

记录封堵器进出鞘管一次后的变形情况。右盘和左盘的直径分别为初始直径的96%和94%（图S2）。

图S2 全降解封堵器的形状恢复百分比。PDO封堵器的形状恢复百分比由释放后的盘直径与初始盘直径之比计算得出（n=3）。**P<0.05。***P<0.001。ns，不显著。

3.4 PDO的体外生物相容性

进行CCK-8和活/死染色以评估PDO的生物相容性。如图2K所示，对照组和PDO组在第1、3和5天的细胞存活率相当。两组活细胞的数量和形态没有明显差异（图S3）。溶血测试显示，PDO组仅观察到不到1%的溶血（图2L）。这些结果表明，PDO无毒性且具有生物相容性。

图S3 L929细胞在3天和5天时的活/死染色。钙黄绿素（绿色）表示活细胞；PI（红色）表示死细胞。

3.5 PDO带来体内炎症减少和内皮化效果良好

为了进一步评估体内生物相容性，将PDO纤维和镍钛合金丝线作为阳性对照进行皮下植入（图3A）。Masson三色染色显示，在第1周、1个月和3个月时，镍钛合金组的胶原蛋白分布密度明显高于PDO组（图3B和C），表明PDO引起的异物反应和纤维化包囊比镍钛合金引起的轻。H&E染色进一步显示，在第1周和1个月时，镍钛合金组以中性粒细胞和巨噬细胞浸润为特征的炎症区域大于PDO和假手术组（图3D和E）。1个月后，PDO引起的炎症反应与假手术组相似。这些数据表明，与镍钛合金相比，PDO诱导的炎症反应强度更小，持续时间更短，具有更强的生物相容性。

图3 PDO单丝在大鼠皮下植入模型中引起较少的纤维化和炎症。（A）PDO单丝和镍钛合金线皮下植入示意图。（B）分别在第1周、1个月和3个月时对假手术组、PDO组和镍钛合金组的组织进行Masson染色。（C）对照组、PDO组和镍钛合金组胶原蛋白体积分数的统计分析（n=3）。（D）对照组、PDO组和镍钛合金组H&E染色的代表性图像。（E）对照组、PDO组和镍钛合金组（n=3）炎症面积分数的统计分析^*P<0.05。^**P<0.01。^***P<0.001。ns，不显著。黑点虚线框表示植入物和组织之间的界面。

巨噬细胞在异物反应中起着核心作用，与炎症持续时间密切相关。巨噬细胞可极化为两种类型：促炎症M1（iNOS⁺）或促修复M2（CD206⁺）表型，这可能受到材料物理和化学性质的影响。为了进一步研究炎症反应，利用免疫荧光来阐明巨噬细胞的表型。如图4A所示，PDO组募集的巨噬细胞（CD68⁺）数量明显低于镍钛合金组。此外，PDO组中更多的M2型巨噬细胞极化，表明PDO诱导的修复过程（图4A）。免疫荧光结果通过免疫组织化学（图S4）和蛋白质印迹（图4B）进一步验证。镍钛合金组CD68和iNOS的表达显著上调，而PDO组CD206的表达上调。这些结果表明，PDO促进了体内的促修复反应。

图S4 一个月后皮下不同植入材料的免疫组织化学染色。假手术组、PDO组和镍钛合金组组织CD68、CD31、iNOS和CD206的免疫组织化学染色。阳性免疫组织化学染色呈棕色。白虚线框表示植入物和组织之间的交界面。

图4 PDO促进修复性巨噬细胞极化和内皮化。（A）植入后1个月CD206、CD68、iNOS的代表性免疫荧光染色。测量平均光密度（AOD）（n=3）。（B）通过蛋白质印迹法测定组织中CD68、CD206和iNOS的蛋白表达水平（n=3）。（C）1个月时组织的CD31免疫荧光染色（n=3）。（D）组织中CD31的蛋白表达水平（n=3）^*P<0.05。^**P<0.01。^***P<0.001。ns，不显著。白色虚线表示植入物和组织之间的界面。

生物可降解材料有利于细胞粘附和浸润，从而促进内皮化进程。为了评估内皮细胞粘附，我们通过免疫荧光和免疫组织化学染色评估了内皮细胞标志物CD31的表达水平。如图4C和图S4所示，与镍钛合金相比，PDO在1个月时显著增加了CD31阳性内皮细胞的强度，表明内皮化进展良好。蛋白免疫印迹法还显示，PDO组CD31的表达水平也显著上调（图4D），表明PDO有利于内皮细胞的粘附和浸润，这可以促进体内内皮化的进程。

3.6 在实验犬VSD模型中植入封堵器并随访3年

针对临床转化，我们进一步评估了PDO封堵器在实验犬VSD模型中的安全性和有效性。该VSD是通过穿孔室间隔和球囊扩张创建的。VSD的直径从4mm到5mm不等。在经胸超声心动图的引导下进行封堵器经导管置入术。在经胸超声心动图引导下，PDO封堵器清晰可见。在调整到适当的位置后，封堵器从输送系统中释放出来。拉动封堵器的成型线使左盘贴靠室间隔，并使双盘成型固定。首次尝试时，所有18个封堵器均成功植入。所有动物在手术后都以良好的身体状况存活下来。手术过程中未出现血肿、心包积液、瓣膜损伤、肢体缺血、呼吸困难或感染等迹象。

图5 PDO封堵器植入实验犬室间隔缺损模型的安全性和有效性。（A）1、3、6、12、24和36个月时心室间隔植入PDO封堵器的宏观视图。（B）植入PDO封堵器的H&E染色。（C）植入PDO封堵器的Masson染色。（D）PDO封堵器的PDO残存区域和内皮细胞覆盖率曲线。（E）植入封堵器的扫描电镜（SEM）在3个月和36个月时与自体心室间隔组织进行了比较。（F）降解和组织再生过程的图示。

在1、3、6、12、24和36个月时，处死3只实验犬，以评估每个时间点生物可降解PDO封堵器的疗效。在大体检查中，封堵器在心室间隔中位置良好，没有移位（图5A）。封堵器表面未发现血栓。在随访期间，PDO封堵器的残留面积逐渐减小，而内皮细胞逐渐覆盖盘面（图5A），表明降解和内皮化的过程。

H&E染色显示，在随访期间，心脏没有发生严重的炎症、血栓或心肌磨损（图5B）。6个月内观察到中度炎症反应。1至6个月内，残留的PDO清晰可见，平均直径为183μm，其逐渐降解。如图5C所示，Masson三色染色显示内皮细胞从PDO骨架的边缘生长到封堵器的中心，胶原蛋白分布包裹PDO丝材。周围心肌完整，未观察到瘢痕形成，表明封堵器不会持续压迫或磨损心脏组织。

如图5D所示，从植入到12个月，内皮覆盖面积的增加幅度明显大于PDO残留面积的减少幅度，表明内皮化速率明显快于降解速率。PDO直到24个月已无残留，而内皮细胞在6个月时可以覆盖和包裹大多数PDO细丝，这表明PDO可以在完全内皮化前作为支架促使内皮细胞粘附，这保证了封堵器的稳定性，避免了残余分流。

扫描电镜显示，PDO丝在3个月时仍存在，被内皮细胞包裹。PDO封堵器在36个月已完全降解，重建了高度纤维化的微结构，与天然心肌的结构相似（图5E）。

图6 实验犬VSD模型的心电图、超声和血液检查。（A）随访期间心电图和心律失常频率的代表性图像。（B）经胸超声心动图图像和左右盘区域分析。封堵器轮廓用白色虚线标出。（C–E）通过超声心动图定量LVEF、LVFS、LVEDV、LVEDS LVIDd和LVIDs（n=3）。（F-H）ALT、AST、ALKP、WBC、RBC和HGB的定量（n=3）。APB：房性早搏；AT：房性快速性心律失常；VPB：室性早搏；VT：室性快速性心律失常；AF：心房颤动。LVEF：左心室射血分数；LVFS：左心室缩短分数；EDV：舒张末期容积；ESV：收缩末期容积；LVIDd：左心室舒张内径；LVIDs：左心室收缩内径。ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；ALKP：碱性磷酸酶；WBC：白细胞；RBC：红细胞；HGB：血红蛋白。

在随访期间，心电图没有观察到致命的心律失常，心律失常的频率是偶然和短暂的（图6A）。随着封堵器的降解，总频率随时间而降低。经胸超声心动图显示封堵器位置良好，在每个时间点逐渐降解（图6B）。有趣的是，左盘的面积减少速度略快于右盘，这可能是由于左心室的血流影响更大（图6B）。封堵器周围未观察到残余分流（图6B）。随访期间，心脏功能和形态在正常范围内（图6C-E）。血液检查和肝脏检查均未发现异常，表明PDO封堵器在长期随访期间无毒性（图6F-H）。肉眼和显微镜检查未发现其他器官（肝、脾、肺和肾）有血栓、梗死或PDO残留（图S6）。

图S6 实验犬模型器官的大体检查和H&E染色。（A）心、肺、肝、肾、脾大体检查。（B）重要器官的H&E染色。

3.7 初步临床试验

为了进一步评估封堵器的安全性和有效性，我们在2020年4月至2020年7月期间对5名膜周部VSD患者进行了经导管植入。患者的中位年龄为4.6岁（范围为3至5岁），中位缺损尺寸为3.7毫米（范围为3-4.5毫米）。在经胸超声心动图的指导下，采用混合经心室入路植入封堵器（图7A）。所有封堵器均已成功植入。未发生心脏骤停、主动脉瓣或三尖瓣反流加重、心包积液或心脏填塞等重大不良事件，也没有患者需要输血。值得注意的是，PDO封堵器在经胸超声心动图下清晰可见，避免了使用X射线引导和造影剂造成的医源性损伤。

在3个月随访期间，通过经胸超声心动图测量封堵的有效性。如图7B所示，所有患者均未检测到残余分流，也未观察到封堵器移位和血栓形成。随访期间，血常规、肝肾功能均在正常范围内（图7C-H）。未观察到新发的心律失常。

图7 PDO封堵器在VSD患者中的临床应用 (A) 在经胸超声心动图（TTE）引导下进行PDO封堵器植入的过程。(B) 3个月的TTE随访。(C–H) 量化ALT、AST、TBIL、CRE、BUN、BUA、HGB和PLT（n = 5）。ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；TBIL：总胆红素；CRE：肌酐；BUN：血尿素氮；BUA：血尿酸；HGB：血红蛋白；PLT：血小板。

讨论

在本研究中，我们研发了一种新型的可完全降解的聚对二氧环己酮（PDO）封堵器。据我们所知，这是第一种专为临床VSD而设计的全降解封堵器。该PDO封堵器有着优异的机械性能、抗疲劳性、生物相容性、降解速率和促进内皮化的性能，并且都通过皮下和心内植入研究得到了验证。对大型动物实验进行的长期随访证实了PDO封堵器的安全性和有效性。封堵器在无新发残余分流或移位的情况下实现了有效封堵，并且其降解速率与组织再生速率匹配。此外，首次的人体试验也证实了PDO封堵器的可行性和安全性，显示出其进一步临床应用的潜力。

VSD是最常见的先天性心脏畸形，占所有心脏异常的40%^[2]。在过去的十年中，已经开发了针对复杂缺损的微创经导管VSD封堵技术。然而，由于当前可用器械在术后发生心脏传导阻滞的高发生率，这种技术并未在大多数中心中实施，也不被指南所推荐。术后心脏传导阻滞的风险不会随着时间的推移而减少，迟发性心脏传导阻滞非常普遍^[25，26]，这可能归因于金属封堵器对于心脏组织的持续压迫和炎症反应。目前已经开发了多种用于封堵先天性心脏缺损的可降解封堵器类型，包括BioSTAR、Carag和BioDisk，主要用于房间隔缺损（ASD）或卵圆孔未闭（PFO）封堵^[21，27-29]。它们大多数保留了金属骨架，有助于封堵器固定成型，提供机械支撑力和X射线可视性。在本研究中，为了改善盘面与组织之间的形状可塑性和力学支撑性，我们设计了一条连接在左盘上的成型线，可以通过拉动成型线来增加封堵器的形态稳定性（图2C）。此外，成型线使封堵器从鞘中释放后结构稳定，顺应性好，不会对周围心肌组织产生过度压迫，从而最大限度地减少心脏磨损和心律失常的风险。此外，我们调节了PDO材料的结晶度和分子量，以提供适当的机械强度（抗拉强度>200 mPa）和形变能力（伸长率>30%），以承受血流冲击和强烈的收缩力（图2I）。最后，超声引导技术的发展促进了完全由合成聚合物制成且不含金属标记的封堵器设计，避免了X射线辐射和金属残留物的使用。总体而言，这些技术设计在物理和生物方面均改进了封堵器，推进了具有复杂解剖结构且与传导路径关系密切的VSD封堵。

炎症与组织破坏和新发性心律失常密切相关^[30]。球囊扩张术和封堵术等手术操作都会导致心律失常。球囊扩张引起的心律失常是暂时的，与扩张过程同步，并且在手术后可以迅速恢复正常节律。然而，封堵器引起的心律失常是持续的，甚至是迟发性的。正如图6A所示，心律失常发生持续超过6个月。因此，随访期间的新发心律失常便归因于封堵器。我们的结果表明，与镍钛合金相比，PDO表现出较少的炎症反应，炎性细胞浸润减轻，M2型巨噬细胞比例更高（图4A和B）。更重要的是，随着封堵器的降解，炎症明显减少，这与实验犬模型中减少的心律失常频率一致（图6A），迟发性心脏传导阻滞的风险有望减轻。

目前，虽然炎症改善的原因尚不明确，但我们尝试去简要讨论其中的原因。一个原因可能是聚合物与金属具有不同的化学特性；另一个原因可能是镍钛合金具有一定的细胞毒性。Ding团队的研究表明，通过引入适当的涂层可以减轻这种金属的细胞毒性，他们在合作研究新的左心耳封堵器（LAA）时揭示了这一点^[31]。他们的LAA封堵器是第一个带有纳米涂层的封堵器，有着更好的细胞反应，最近已迅速应用于全球的心脏病介入治疗中。由于我们在VSD封堵器研究中的对照组是没有涂层的镍钛合金，因此我们无法区分哪个是主要原因。尽管如此，我们研发了首个临床上的全降解VSD封堵器，在使用可降解医疗器械以避免晚期并发症方面具有其自身的价值。

可降解封堵器研发面临的主要挑战是实现材料降解速度与心脏组织修复周期之间的平衡^[12]。Ding等人曾利用聚乳酸（PLLA）作为骨架和阻流膜^[20]。PLLA易于获得、成本低廉且具有良好的加工性能。然而，PLLA封堵器的3年随访显示，5名房间隔缺损（ASD）患者中有3名出现残余分流，并且分流大小随时间增加^[18]。我们假设心室的较高血流冲击可能加速PLLA框架的降解并延迟其内皮化。我们的结果与先前的研究一致，显示含醚键的PDO有利于内皮化^[32，33]。因此我们选择PDO用于骨架，PLLA用于阻流膜。实验犬VSD模型证实了封堵器内皮化速率高于其降解速度，且其骨架在6个月内保持稳定，同时6个月也是内皮化稳定修复所需的时间窗口期。有趣的是，在实验犬模型中，左盘的降解速度略快于右盘，这可能是由于左心室的较大血流冲击所致，但在6个月的随访期间，两盘面结构依然保持完整，证明在强烈血流冲击下封堵器的降解性能与体内修复周期仍相匹配。

本研究中包含的5名患者的初步临床试验显示出令人鼓舞的结果。所有封堵器植入均成功且未发生不良事件。封堵器在3个月时保持完整形态并紧贴室间隔，无残余分流。在随访期间均未观察到致命性心律失常。在一项多中心、随机、对照的临床试验中，我们共招募了108名患者并进行1年的随访，以验证这种新型封堵器用于VSD封堵的效果（NCT03941691）。然而，我们的研究在未来工作中仍有一些局限性。首先，需要进一步研究PDO减轻炎症和纤维化的机制。其次，尽管通过肋间小切口手术操作更容易且释放封堵器更安全，但通过外周血管的经皮介入术可以最大限度地减少手术创伤和术中失血危险。此外，经皮封堵使用的长鞘具有较小的内径和弯曲的柔软头端，而经胸封堵使用的短鞘是直的且内径较大。同时，下一代通过外周血管的输送系统正在开发中。最后，我们需要对更多患者进行长期随访和对更大规模的患者进行群体评估，以充分验证该封堵器用于VSD封堵的效果。

结论

综上所述，PDO封堵器具备较好的生物相容性、机械稳定性、降解速率、减轻炎症反应和促进内皮化等优势，是经导管VSD封堵的强力候选者。我们期望PDO封堵器在未来的临床试验中能够展示其安全性和有效性。

附录A. 补充数据可在以下网址在线查阅：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.12.018

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